Dans la même période, il enseigne la musique au séminaire de Rome et organise les festivités musicales du Cardinal d'Este. En 1570, il reprend ses anciennes fonctions de maître de la chapelle Giulia, et entreprend la réforme du répertoire grégorien, dont la polyphonie est jugée trop complexe.
En 1571, il reprend son poste de maître de musique à Saint-Pierre-de-Rome qu'il gardera jusqu'à sa mort. Après le décès de sa femme et de deux de ses enfants d'une épidémie de peste, il se remarie en 1581 avec une riche veuve, et peut ainsi publier sa musique et créer ses plus belles œuvres.
Palestrina est considéré comme le garant de la tradition en synthétisant l'art contrapuntique du XVIème siècle dans son œuvre essentiellement vocale et religieuse. Il suit les consignes pontificales dans l'intelligibilité du texte, et la soumission de la musique au message liturgique.